绝色诱惑

肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)和变栖克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)庸碌定殖于东说念主类、动物肠说念和自然环境中[1]，是常见的进攻要求致病性革兰氏阴性菌。肺炎克雷伯氏菌是临床感染和社区获取性感染的主要病原菌[2]，可导致肺炎、尿路感染、腹腔感染、血液感染、脑膜炎和化脓性肝脓肿等多种疾病[3-4]，发病率和死亡率呈逐年升高态势。而变栖克雷伯氏菌行动一种新兴趣病菌成人色情网，连年来不休出现东说念主类临床感染病例[5]。Garza-Ramos等[6]在2015岁首次报说念了高黏性K. variicola分离株。2017年在英国报说念一齐来清高症监护病房的软组织K. variicola感染病例，该分离株产IMI-2碳青霉烯酶，对厄他培南、好意思罗培南和亚胺培南耐药[7]。2018年报说念了一齐来自中国上海某病院儿科重症监护室别称2岁女童感染病例，从患者导尿管等分离了具有高黏表型K. variicola SHET-01菌株，该菌株对碳青霉烯类抗生素好意思罗培南、亚胺培南和厄他培南耐药[8]。2021年从儿科患者样本等分离到一株高黏表型K. variicola株，其质粒佩戴blaNDM-1和blaIMP-4基因[8]。流行病学有筹商发现，K. variicola导致的血液感染死亡率以至跳动K. pneumoniae感染[9]。因此，面临多重耐药克雷伯氏菌激励的专家卫生学潜在风险挑战，研发替代抗生素的新式疗法大势所趋[10]。

噬菌体(bacteriophages)是一类特异性感染细菌、真菌、放线菌等微生物的病毒，是地球上最具生物万般性的生命体，于泥土、水体、空气或动植物体内等多种环境中庸碌散布，自1915年发现噬菌体于今，针对噬菌体的有筹商为意志微生物互作、生态系统均衡和东说念主类健康等方面提供了进攻的科学价值[11]。噬菌体具有高度专一性的性情[12]，在介导宿主菌快速裂解死亡的同期，险些不会影响东说念主类或动物细胞，透露出极高的生物安全性[13]。因此，噬菌体偏执繁衍卵白在临床实践性应用和关结合洽中得到有趣。以色列别称患者左胫骨感染庸碌耐药鲍曼不动杆菌和多重耐药肺炎克雷伯氏菌，经过噬菌体和抗生素长入诊治后，组织赶快愈合且感染处细菌培养物呈阴性，患者幸免截肢[14]；Yehl等[15]通过定点突变对T3噬菌体尾纤维卵白中的宿主范围决定区域进行革新，令宿主范围扩大，革新后的噬菌体在体外训诫及小鼠模子内阐明邃密作用，灵验幸免了抗性菌株的出现；源自葡萄球菌(Staphylococcus)噬菌体JD007的细胞壁水解酶JDlys对不同起首和不同多位点序列分型(multilocus sequence typing， MLST)的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus， MRSA)菌株进展出强裂解活性，有筹商东说念主员发现该水解酶与细胞穿透肽组成的会通卵白巧合灵验断根细胞内的MRSA，并遏制小鼠皮肤中MRSA的增殖，从而裁减伤口愈合进程[16]。值得防护的是，由于变栖克雷伯氏菌与肺炎克雷伯菌群(Klebsiella pneumoniae complex)其他成员具有近似的生化和表型特征，变栖克雷伯氏菌的流行被严重低估，导致对其关连噬菌体有筹商的浮泛。

因此，行动一种潜在的替代抗生素的新兴疗法，噬菌体具有极其权臣的临床应用上风。本有筹商针对K. pneumoniae与K. variicola临床分离株，从多种样本等分离纯化得到5株裂解性噬菌体，对其生物学性情、基因组组成和内溶素(endolysin)进化特征进行系统分析，为进一步合理期骗噬菌体资源提供表面依据，奠定了噬菌体诊治决策的研发基础。

1 材料与方法 1.1 菌株起首

分离噬菌体所用宿主菌(1株K. variicola和3株K. pneumoniae)样品均采集自唐山市某病院，均由本实践室分离并置于–20 ℃甘油水冻存收藏。菌株信息NMDCX0000171存储在国度微生物科学数据中心(National Data Center for Microbial Sciences， NMDC)，结合为https://nmdc.cn/resource/genomics/attachment/detail/NMDCX0000171。

1.2 噬菌体分离纯化

样本采集自唐山市某病院东说念主类粪便、养猪场粪便和广州市西朗浑水处分厂。关于粪便样品，将2 g置于15 mL离心管，补加无菌水至10 mL，充分混匀制成悬浊液，浑水样品则取10 mL径直进行下步操作。样品8 000 r/min离心10 min，将上清液通过0.22 μm水系微孔滤膜过滤至新的离心管内。将5 mL MH(B)培养基、1 mL上清滤液和100 μL过夜培养的细菌培养物在另一15 mL离心管中混匀，35 ℃要求150 r/min连气儿培养12 h。培养液再次离心，上清液过滤后4 ℃保存备用。取100 μL宿主菌液与8 mL预热的半固体培养基[40–50 ℃，MH(B)培养基+0.7%琼脂]混匀，倾倒于底层固体MH(A)平板，滴加10 μL滤液[17]，待液体干燥后极度于35 ℃恒温箱中连气儿培养12 h，技能屡次不雅察是否有透明噬菌斑出现。

使用双层平板法对噬菌体进行纯化[18]，挑取双层平板名义出现的单个噬菌斑，10倍梯度连气儿稀释，吸取适合稀释度下100 μL噬菌体液与等体积宿主菌液混匀，35 ℃要求下吸附10 min，加入8 mL预热的半固体培养基，极度混匀后倒入MH(A)平板，冷却凝固后35 ℃要求下极度培养12 h。以上设施重复3–5次，至噬菌斑形式、大小均一不再变化，即获取单一噬菌体。上述操作均在无菌要求下进行。

1.3 噬菌体生物学性情的测定 1.3.1 噬菌体形式学不雅察

使用负染色法进行电镜样品染色，将10 μL样品滴于石蜡封口膜，铜网正面朝下倒扣至样品静置1 min，吸走敷裕样品液后以相同方法倒扣于磷钨酸染色液，静置1 min，室温下干燥。通过透射电子显微镜JEM-1400 flash在120 kV下不雅察并拍摄噬菌体的形式特征。

1.3.2 宿主谱

参照文件[19]的有筹商方法，取本实践室收藏的克雷伯氏菌重新复壮[菌株信息NMDCX0000172存储在国度微生物科学数据中心(NMDC)，https://nmdc.cn/resource/genomics/ attachment/detail/NMDCX0000172]以获取增殖菌液，将100 μL菌液与预热的半固体培养基混匀，倾倒于固体平板名义，待表层培养基凝固后，取10 μL噬菌体富集液滴于半固体培养基名义，于恒温培养箱35 ℃极度培养12 h。期骗器具REALPHY 1.13[20]进行受试菌株全基因组进化树的绘画，使用iToL (https://itol.embl.de/)对系统发育树进行可视化和注目。

1.3.3 温度及酸碱默契性

将6组1 mL噬菌体纯化液辞别置于–20、4、37、50、60、70 ℃要求下处分1 h，通过双层平板法测定效价以评估其温度默契性。

使用HCl和NaOH溶液将MH(B)培养基调整pH至2.0、4.0、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0，取噬菌体纯化液100 μL与900 μL上述液体混匀，37 ℃孵育1 h，通过双层平板法测定效价以评估其酸碱默契性[21]。

勾引英文 1.3.4 一步滋长弧线

将噬菌体与宿主菌以0.01的比例混匀[21]，于35 ℃孵育10 min吸附噬菌体。10 000 r/min离心1 min汇注细菌，弃去上清，用簇新MH(B)洗涤2次，之后重悬千里淀并添加MH(B)至5 mL，将离心管轰动混匀，计为0时刻，远离10 min取样并经10 000 r/min离心1 min，取表层清液通过双层平板法测定效价，绘画一步滋长弧线。

1.3.5 体外抑菌实践

将对数滋始终的菌株培养物，用MH(B)稀释，调OD595值为0.15，将稀释后的菌株培养物分装至4只无菌离心管内，每管10 mL，竖立4个组，1个对照和3个实践组(表 1)。对照组，离心管加入等体积MH(B)培养基；实践组1 [感染复数(multiplicity of infection， MOI)=10]，10 mL菌株培养物加入等体积噬菌体液(以MOI为10的比例)；实践组2 (MOI=1)，10 mL菌株培养物加入等体积噬菌体液(以MOI为1的比例)；实践组3 (MOI=0.1)，10 mL菌株培养物加入等体积噬菌体液(以MOI为0.1的比例)。每组充分混匀后，辞别分装至1.5 mL离心管，37 ℃、180 r/min培养，每3 h取样并测定595 nm处的吸光度，连气儿测定24 h，每组重复3次，绘画噬菌体体外抑菌弧线。

1.3.6 噬菌体对大蜡螟幼虫的体内抑菌成果

重新复苏多重耐药变栖克雷伯氏菌BS375-3，进行活菌计数并调整其菌量为2×104、2×105、2×106 CFU。将体重为200–250 mg的大蜡螟(Galleria mellonella)幼虫速即分为3组，每组10只，饥饿处分24 h。使用70%的乙醇对大蜡螟幼虫进行体表消毒，自尾部第一左足处打针K. variicola BS375-3菌液(20 μL/只，2×104、2×105、2×106 CFU)，置于37 ℃阴雨培养箱，禁食处分，每隔4 h纪录存活率，连气儿纪录96 h。2×105 CFU感染的大蜡螟幼虫在96 h内死亡率为70%，被用于厚爱训诫的感染菌量。

将体重为200–250 mg的大蜡螟幼虫速即分为6组，每组10只，禁食处分24 h，使用70%医用乙醇进行体表消毒。关于空缺对照组及噬菌体处分组，当先自尾部第一左足处打针20 μL磷酸盐缓冲液(phosphate buffered solution， PBS)，30 min后自对侧足部辞别打针等量PBS和噬菌体pKV-BS375-3.1 (2×107 PFU)；关于其余训诫组，当先自尾部第一左足处打针20 μL K. variicola BS375-3菌液20 μL (2×105 CFU)，30 min后在对侧足部辞别打针等量的PBS、pKV-BS375-3.1 (2×107、2×106、2×105 PFU，表 2)。将幼虫置于37 ℃阴雨环境培养箱中，禁食处分，每隔4 h纪录存活率，连气儿纪录96 h。不雅察黑化情况和存活率[22]。

1.4 噬菌体全基因组测序

期骗Illumina NovaSeq 6000测序平台进行全基因组测序(广东好意思格基因科技有限公司)。DNA样品检测及格后构建文库，禁受软件Soapnuke对测序的数据质地进行评估以及去除低质地数据成人色情网，确保收尾真确度。使用Megahit软件对clean data进行de novo拼装。

1.5 噬菌体基因组功能注目分析

基于NCBI在线器具BLASTn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)进行噬菌体全基因组序列比对，使用MetaGeneMark (v3.38)进行基因组基因算计，期骗BLASTp (e＜10–3)将所算计基因氨基酸序列与UniProtKB数据库的病毒序列(ViralZone， reviewed protein， https://viralzone.expasy.org/)进行比对，同期将噬菌体序列提交至pfam数据库()进行注目，结合以上2种方法获取校正注目收尾。使用软件SnapGene software (from Insightful Science; available at snapgene.com)绘画噬菌体全基因组图谱；基于耐药基因数据库CARD (https://card.mcmaster.ca/)对5株噬菌体进行分析，算计是否佩戴抗生素耐药基因(antibiotics resistance gGenes， ARG)；下载毒力因子数据库VFDB ()的set A中枢数据库，通过BLAST比对算计噬菌体是否佩戴毒力因子。

1.6 噬菌体内溶素系统进化分析

在GenBank数据库中下载噬菌体endolysin氨基酸序列，竖立数据集。包括克雷伯氏菌噬菌体分离年份、国度、endolysin卵白类型等信息，通过MEGA-X构建噬菌体endolysin系统发育树，使用iToL (https://itol.embl.de/)对系统发育树进行可视化。

2 收尾与分析 2.1 噬菌体的生物学性情 2.1.1 噬菌斑及形式特征

本有筹商以K. pneumoniae BM327-1、M186-2、BS317-1及K. variicola BS375-3为宿主菌，自浑水、唐山市东说念主类粪便及养猪场粪便样本等分离并定名5株噬菌体(表 3)。5株噬菌体与宿主菌培养后可形成1–2 mm直径的噬斑，且外侧均有半透明晕环。透射电镜下不雅察到噬菌体pKP-BM327-1.2、pKP-M186-2.1、pKP-M186-2.2和pKV-BS375-3.1头部直径在52–74 nm之间，具有不成伸缩的短尾，其长度在11–27 nm之间；噬菌体pKP-BS317-1.1具有不成伸缩的长尾形式，头部直径约为58.15 nm，尾长约153.26 nm (图 1)。

2.1.2 宿主谱

噬菌体pKP-M186-2.1、pKP-M186-2.2和pKP-BS317-1.1仅能裂解对应宿主菌K. pneumoniae M186-2 (ST111型)、M186-2 (ST111型)和BS317-1 (ST1035型)，而噬菌体pKP-BM327-1.2除能裂解其宿主菌K. pneumoniae BM327-1 (ST1565型)外，还能裂解与BM327-1疏浚ST型的K. pneumoniae BS329-2和K. pneumoniae BM337-1。比拟之下，K. variicola噬菌体pKV-BS375-3.1具有较为平淡的宿主谱，除裂解宿主菌K. variicola BS375-3 (ST4115型)外，还能裂解分离自病院东说念主类粪便样品的5株K. variicola (BS369-2、BM366-1、BS327-2-1、BS325-2、BS359-3，均为ST4115型)和2株Klebsiella quasipneumoniae (BS419-1、BM419-3，均为ST2355型)，以及马来穿山甲起首的K. pneumoniae (M169-3，ST101型) (图 2)。

2.1.3 温度及酸碱默契性

本有筹商等分离的5株噬菌体的效价在–20–37 ℃保握默契，大于37 ℃则温度升高时效价赶快贬低，与37 ℃时效价比拟，在60 ℃孵育1 h后的效价均极权臣着落(P＜0.001)，其中噬菌体pKP-BM327-1.2和pKV-BS375-3.1在60 ℃孵育1 h后透澈失去活性(图 3A)。

5株噬菌体在pH为2和12的环境下孵育1 h后均透澈失活，但不同起首噬菌体分离株的最适pH存在一定互异。噬菌体pKP-BM327-1.2在pH为8的弱碱环境下效价最高[lg (PFU/mL)为10.22]，噬菌体pKP-M186-2.1与pKP-M186-2.2在pH为7的中性环境下效价最高[lg (PFU/mL)辞别为9.00和9.79]，而噬菌体pKP-BS317-1.1和pKV-BS375-3.1则在pH为6的弱酸环境下具灵验价最高[lg (PFU/mL)辞别为8.88和8.58] (图 3B)。

2.1.4 噬菌体一步滋长弧线

噬菌体一步滋长弧线的测定发现，噬菌体pKP-BM327-1.2和pKP-M186-2.1潜藏期最长(20 min)，噬菌体pKP-BM327-1.2在第70分钟竣事裂解期干涉平台期，而噬菌体pKP-M186-2.1裂解期握续60 min干涉平台期。噬菌体pKP-M186-2.2潜藏期小于10 min，在第60分钟干涉平台期。噬菌体pKP-BS317-1.1潜藏期为10 min，在80 min时干涉平台期；噬菌体pKV-BS375-3.1潜藏期小于10 min，该噬菌体在50 min时干涉平台期(图 3C)。

2.1.5 噬菌体体外抑菌成果

以未加噬菌体的细菌培养物行动对照，通过24 h内测定OD595评估5株噬菌体不同MOI (10、1、0.1)的体外抑菌成果。K. pneumoniae BM327-1培养物OD595在12 h内握续加多，以MOI为10的比例加入噬菌体pKP-BM327-1.2透露出最佳的抑菌成果，3 h内透澈遏制宿主菌株的滋长(图 4A)；具有合并宿主菌(K. pneumoniae M186-2)的噬菌体pKP-M186-2.1和pKP-M186-2.2进展出不同的体外抑菌成果：噬菌体pKP-M186-2.1可握续抑菌3 h，且与感染复数未进展出关连性(图 4B)，而以MOI为10的比例加入噬菌体pKP-M186-2.2后不错在6 h内透澈遏制细菌增殖，以MOI为1和0.1添加噬菌体时，前3 h弧线呈高潮趋势(图 4C)，标明低剂量的噬菌体pKP-M186-2.2抑菌成果较差；噬菌体pKP-BS317-1.1和pKV-BS375-3.1具有相似的体外抑菌成果，2株噬菌体均可握续遏制细菌达6 h (图 4D、4E)。自然5株噬菌体具有万般化的体外抑菌成果，但由于噬菌体抗性突变菌株的出现及增殖，体外抑菌弧线均会在3 h或6 h后呈现高潮趋势。

2.1.6 噬菌体对大蜡螟幼虫的体内抑菌成果

基于体外抑菌成果，选拔噬菌体pKV-BS375-3.1进行大蜡螟幼虫体内抑菌训诫。空缺对照和噬菌体处分组未发现大蜡螟幼虫的黑化和死亡(图 5A、5B)。大蜡螟幼虫感染组，在感染30 min后辞别打针PBS和不同MOI比例的噬菌体。与空缺对照组比拟，感染但未经噬菌体处分组的大蜡螟幼虫在96 h内全部黑化，死亡率为90% (图 5C)。感染后经MOI为100、10、1噬菌体处分组的大蜡螟幼虫96 h内死亡率辞别为20%、60%和60% (图 5D–5F)。Kaplan-Meier分析透露，感染后噬菌体处分组(MOI为100)大蜡螟幼虫96 h内存活率极权臣高于感染对照组(K. variicola BS375-3+PBS)大蜡螟幼虫(P＜0.001)。感染后噬菌体处分组(MOI为10和1)的大蜡螟幼虫在96 h内存活率均为40%，但与感染对照组(K. variicola BS375-3+PBS)不存在权臣互异(P＞0.05，图 5G)。

2.2 噬菌体基因组特征

5株噬菌体基因组已提交至GenBank，登录号见表 3。5株噬菌体均未佩戴耐药基因和毒力因子，噬菌体pKP-BM327-1.2基因组全长76 991 bp，GC含量为44.16%。左证海外病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses， ICTV)分类轨范，与现存的噬菌体核酸序列跳动95%即为合并种，相似性大于50%可归为合并属[23]。通过BLASTn比对，该噬菌体为Schitoviridae科成员，与Klebsiella phage vB_KpnP_P184 (NC_055919.1)的同源片断一致性最高(query cover=87%， Per. Ident=94.75%)。

噬菌体pKP-M186-2.1基因组全长42 894 bp，GC含量为51%；pKP-M186-2.2基因组全长44 728 bp，GC含量为53.83%；噬菌体pKV-BS375-3.1基因组全长45 617bp，GC含量为51.85% (表 1)。三者同属于Autographiviridae科成员，但噬菌体pKP-M186-2.1与pKV-BS375-3.1同属于Molineuxvirinae亚科成员，其中噬菌体pKP-M186-2.1与Klebsiella phage IME184 (MZ398244.1)同源片断的一致性最高(query cover=83%， Per. Ident=93.45%)，噬菌体pKV-BS375-3.1与Proteus phage PmP19 (MT680615.1)的同源片断一致性最高(query cover=87%， Per. Ident=95.08%)；而pKP-M186-2.2属于Slopekvirinae亚科、Drulisvirus属的成员，与Klebsiella phage KP34 (NC_013649.2)的同源片断一致性最高(query cover=87%， Per. Ident=92.09%)。

噬菌体pKP-BS317-1.1则属于Drexlerviridae科Webervirus属的成员，基因组全长48 933 bp，GC含量为50.22%，与Klebsiella phage IME268 (MZ398242.1)的同源片断一致性最高(query cover=92%， Per. Ident=94.74%) (表 3)。

2.3 噬菌体基因功能与比较基因组学分析

本有筹商中噬菌体基因功能注目率较低(20%–30%)，大部分编码序列(coding sequence， CDS)为未知功能卵白，被注目的基因合座上呈模块化结构，包括DNA复制与转念模块、结构卵白模块、裂解模块以及DNA包装模块，5株噬菌体均未佩戴溶源关连基因(图 6)。

噬菌体pKP-BM327-1.2结构卵白包括尾丝卵白、尾卵白、主要的衣壳卵白、卷尺卵白；结尾酶大亚基和派别卵白为包装卵白；胸苷酸合酶、核苷二磷酸还原酶、HNH归巢内切酶、单链DNA结合卵白和RNA团员酶等；内肽酶和穿孔素组成了噬菌体pKP-BM327-1.2的裂解系统。

噬菌体pKP-M186-2.1的结构卵白包括尾突卵白、尾纤维卵白、基板中心卵白、尾管卵白和头尾结合卵白，这些卵白组成了噬菌体的卵白外壳及尾部形式；结尾酶大亚基为噬菌体包装关连卵白；DNA复制和转念卵白包括DNA团员酶、DNA解旋酶和RNA团员酶等；裂解关连卵白为内肽酶；此外，CDS 41编码Ocr卵白，该卵白具有阻断I型DNA亏损酶的DNA结合功能，因此不错禁止噬菌体DNA被宿主细菌亏损酶切割。

噬菌体pKP-M186-2.2基因组的结构卵白包括尾丝卵白、尾管卵白、主要的衣壳卵白和头尾结合卵白；包装关连卵白为结尾酶大亚基；裂解关连卵白包括信号锚开释内溶素(signal-anchor-release endolysin， SAR-endolysin)和膜会通卵白(U-spanin)，SAR-endolysin在噬菌体感染周期中被合成为无酶活性的合座膜卵白，然后从膜中开释后通过构象重构被激活， 可降解宿主肽聚糖，并与pinholin和spanin卵白一齐参与导致宿主细胞要领化裂解开释练习病毒颗粒的一系列事件。一朝pinholin浸透了宿主细胞膜，SAR内溶素便被开释到周质并水解肽聚糖层。膜会通卵白可使外膜与内膜会通，促进子代病毒粒子的开释。DNA复制和转念卵白包括DNA团员酶、核苷酸激酶和RNA团员酶。

噬菌体pKP-BS317-1.1具有丰富的尾部关贯串构卵白，包括尾丝卵白、尾尖附着卵白、尾尖组合卵白、尾尖卵白、卷尺卵白、噬菌体尾部拼装伴侣卵白、尾管卵白；包装卵白包括结尾酶小亚基和结尾酶大亚基；DNA复制和转念卵白包括单链DNA结合卵白、DNA转录结合调控因子Cro、腺嘌呤甲基化酶等；噬菌体的裂解系统为典型的“穿孔素-裂解酶”二元裂解系统，由穿孔素、裂解酶和U-spanin组成。

噬菌体pKV-BS375-3.1的结构卵白包括尾管卵白、尾丝卵白和讳饰卵白；包装卵白包括派别卵白和结尾酶大亚基；DNA复制和转念卵白包括RNA团员酶、DNA解旋酶和DNA团员酶等；肽聚糖水解酶gp36为裂解关连卵白。

2.4 噬菌体内溶素的系统发育分析

基于GenBank数据库筛选克雷伯氏菌噬菌体内溶素氨基酸序列，并与本有筹商中的克雷伯氏菌噬菌体共同构建内溶素氨基酸序列系统发育树。本有筹商中，Przondovirus属噬菌体编码的内溶素为水解聚糖与多肽间酰胺键的N-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸酰胺酶，pKP-M186-2.1与Autographiviridae、Molineuxvirinae眷属的Klebsiella phage vB_KpnP_ZK1、Klebsiella phage Kp7和Klebsiella phage K1-ULIP33处于合并分支，该分支噬菌体所编码的内溶素为内肽酶，作用于四肽侧链和五肽交联桥上的肽键，具有疏浚作用位点内溶素的还有Slopekvirus、Sugarlandvirus属噬菌体。Taipeivirus、Lastavirus和Youseivirus属噬菌体编码的裂解酶是作用于

聚糖β-1， 4糖苷键的N-乙酰基胞壁质酶。噬菌体pKP-BS317-1.1与Webervirus属的其他噬菌体处于合并分支，该分支噬菌体编码的裂解酶为信号锚开释内溶素(SAR-endolysin)，该裂解酶当先以无裂解活性的体式分泌，通过N结尾SAR结构域锚定在膜上，以幸免受感染的宿主过早裂解[24]。因此，本有筹商中克雷伯氏菌噬菌体内溶素透露功能万般性，且内溶素在克雷伯氏菌噬菌体属间保守(图 7，内侧二层)。N-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸酰胺酶型内溶素噬菌体分离自中国和好意思国，内肽酶型内溶素噬菌体分离自中国、好意思国、法国和德国，N-乙酰基胞壁质酶型内溶素的噬菌体分离自好意思国、塞尔维亚和韩国，指示内溶素的类型与地域无较着关联(图 7，外侧一层)。

3 参议与论断

噬菌体是自然存在且特异性裂解细菌的病毒[25]，在针对多重耐药菌的抢救性诊治方面透露出邃密成果[12， 26]，噬菌体诊治已成为后抗生素期间细菌诊治的有筹商热门[27]。本有筹商以3株K. pneumoniae和1株K. variicola为宿主菌，从浑水、东说念主类粪便及猪粪便等分离出4株K. pneumoniae噬菌体(pKP-BM327-1.2、pKP-M186-2.1、pKP-M186-2.2和pKP-BS317-1.1)与1株K. variicola噬菌体(pKV-BS375-3.1)。5株噬菌体在–20–37 ℃保握较为默契的活性。仅有少数报说念其分离的噬菌体可在一定技能内耐受高温[19]，在高温威胁下，噬菌体可通过基因突变、卵白质转变进而发生适合性进化来保握本人的默契性和复制才能，从而促进其对高温环境的适合[28-31]。

噬菌体pKP-BM327-1.2潜藏期长达20 min，而pKV-BS375-3.1潜藏期小于10 min，有有筹商以为噬菌体的裂解技能与穿孔素(holin)密切关连[32]。穿孔素是由双链DNA (dsDNA)噬菌体编码的一类具有跨膜结构域(transmembrane do-main， TMD)、多达52个科(7个超科)的膜卵白[33]，被称为细菌裂解的“分子定时器”。李艳[34]的有筹商发现，穿孔素的突变发生在跨膜区前端的序列中时，裂解技能与野生株收支不外5 min，而突变发生在第二跨膜区序列时，裂解技能为5 (M73L)–50 min (L82Q)，具有极权臣互异，标明holin卵白跨膜结构域的氨基酸互异对噬菌体的裂解技能具有进攻影响。

噬菌体pKP-BM327-1.2、pKP-M186-2.1、pKP-M186-2.2和pKV-BS375-3.1在电镜下形式相似，均为短尾噬菌体(图 1)。结合噬菌体基因组聚类分析，pKP-BM327-1.2属于Schitoviridae科成员，仅与Klebsiella phage vB_KpnP_P184 (query cover=87%， Per. Ident=94.75%)和vB_KpP_FBKp27(query cover=87%， Per. Ident=93.61%)同源性较高，标明pKP-BM327-1.2可能为一种新式噬菌体[23]。pKP-M186-2.1和pKV-BS375-3.1属于Autographiviridae科、Molineuxvirinae亚科成员，但无法笃定种属。pKP-M186-2.2属于Autographiviridae科、Slopekvirinae亚科、Drulisvirus属的成员，与Klebsiella phage KP34同源性最高(query cover=87%， Per. Ident=92.09%)。而pKP-BS317-1.1为典型的长尾噬菌体(尾部长度约为153 nm)，属于Drexlerviridae科、Webervirus属的成员。

噬菌体的宿主范围主要取决于噬菌体编码的受体结合卵白(receptor binding proteins， RBPs)[35]，其主要身分包括尾纤维或者尾刺卵白。RBPs介导噬菌体与宿主细胞名义受体的开动战争，何况关于启动感染进程至关进攻[36]。本有筹商中，3株噬菌体进展出宿主特异性，pKP-M186-2.1、pKP-M186-2.2和pKP-BS317-1.1仅裂解原宿主菌，而对其余受试菌无裂解作用；而噬菌体pKV-BS375-3.1具有宽宿主谱，可裂解受试菌中的8株细菌，包括3个菌种：肺炎克雷伯氏菌、变栖克雷伯氏菌及准肺炎克雷伯氏菌。绝大巨额克雷伯氏菌噬菌体将胞外荚膜多糖行动开动受体，它们的RBPs多透露解聚酶活性[37-38]，不错主动结合和降解荚膜多糖[39]。噬菌体pKP-M186-2.1基因组中，ORF2被pfam注目为果胶酸裂解酶眷属卵白(pectate lyase superfamily protein)，也被注目为刺突卵白，与已有有筹商描摹中解聚酶与结构卵白分享盛开阅读框(open reading frame， ORF)，使得噬菌体尾刺结构卵白具有解聚酶活性相符。

内溶素(endolysin)是噬菌体感染细菌的后期合成的一种细胞壁水解酶[40]，参与肽聚糖的水解以开释噬菌体后代[41]。有筹商标明，253个乳酸菌噬菌体佩戴10种不同类型的内溶素[41]。此外分枝杆菌噬菌体中也不雅察到此类情状，感染了耻垢分枝杆菌mc2155的220个噬菌体中找到26个内溶素结构[42]。本有筹商中克雷伯氏菌噬菌体内溶素包括N-乙酰胞壁酰-l-丙氨酸酰胺酶、内肽酶、N-乙酰基胞壁质酶和SAR-endolysin等，与上述有筹商中巧合感染合并属(或种)细菌的噬菌体所佩戴的endolysin呈现万般化相似。

本有筹商中，不同噬菌体进展出不同的体外抑菌成果。合座来说，噬菌体在前3–6 h抑菌成果最佳，随后出现噬菌体抗性菌。先前的有筹商标明，肺炎克雷伯氏菌噬菌体P24在1 h内裂解杀死108 CFU/mL宿主菌，并握续遏制细菌滋长4 h [43]，与之比拟，本有筹商中所分离噬菌体具有更长的抑菌技能。噬菌体抗性菌的出现是噬菌体疗法的进攻挑战，但噬菌体抗性可能会导致细菌抵御生素耐药性的丧失。有筹商标明，K. pneumoniae 77与噬菌体KP36作用后，约半数突变株(14/31)的质粒丢失blaCTX-M、ant(3’’)、sul2、folA、mph(E)/mph(G)基因，从而归附抵御生素的明锐性[44]。另一有筹商发现，对长时霉素和达托霉素耐药的粪肠球菌由于Epa (胞外多糖生物合成基因)的突变而产生了对噬菌体的抗性，但对细胞壁和细胞膜靶向抗生素重新明锐[45-46]。不仅如斯，噬菌体抗性的出现还会导致细菌毒力的贬低，举例，单核增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)被解说获取噬菌体抗性后磷壁酸糖基化基因发生突变，这导致其在小鼠体内模子中毒力减轻，以及对Caco-2上皮细胞和HepG2肝细胞细胞系的入侵弱势[47]。因此，噬菌体鸡尾酒疗法或噬菌体与抗生素长入诊治关于督察和遏制噬菌体抗性菌的出现具有邃密出路。

本有筹商对变栖克雷伯氏菌噬菌体pKV-BS375-3.1的体内抑菌成果进行评估，收尾透露打针噬菌体pKV-BS375-3.1不会导致大蜡螟幼虫死亡(图 5B)，与噬菌体具有较高的生物安全性相符[22， 48-49]。高剂量噬菌体(MOI为100)与其他组比拟，在保护细菌感染的大蜡螟幼虫上具有权臣述用，而以中剂量(MOI为10)和低剂量(MOI为1)的噬菌体与感染对照组比拟，无权臣性互异(图 5G)，不错以为噬菌体的诊治成果与噬菌体数目呈正关连性。现在，有筹商东说念主员对变栖克雷伯氏菌噬菌体的探究较少，仅发现Ghanaim等[50]和Senevirathne等[51]的关连报说念。变栖克雷伯氏菌噬菌体KPP-1在韩国淡水样品中被分离，属于Vequintavirinae亚科、Mydovirus属[51]。基于NCBI在线器具Blastn (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)进行噬菌体全基因组序列比对，与本有筹商中变栖克雷伯氏菌噬菌体pKV-BS375-3.1基因组未发现权臣相似性，指示变栖克雷伯菌噬菌体具有万般性。噬菌体KPP-1仅可裂解32株受试菌中的2株(均为变栖克雷伯氏菌)，而本有筹商中噬菌体pKV-BS375-3.1具有更宽的宿主范围(图 2)。另外，噬菌体pKV-BS375-3.1的抑菌成果(图 4E)优于KPP-1 (3 h内权臣遏制宿主的滋长)，变成这种互异的机制还需要进一步探究。因此，本有筹商中关于裂解多株受试菌的变栖克雷伯氏菌噬菌体生物学性情的全面表征可为后续应用及有筹商提供表面依据。

总之，本有筹商等分离并分析了4株肺炎克雷伯氏菌噬菌体和1株变栖克雷伯氏菌噬菌体生物学表型，它们被归类于Schitoviridae、Molineuxvirinae、Drulisvirus和Webervirus眷属成员成人色情网，均具有邃密的体外抑菌活性。尤其是具有宽宿主谱、短潜藏期的变栖克雷伯氏菌噬菌体pKV-BS375-3.1在诊治Klebsiella sp.感染方面具有潜在应用价值。内溶素在克雷伯氏菌噬菌体中呈万般性和属内保守性，这一发现为噬菌体抗菌药物研发提供进攻启示。